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《天根质粒提取》

来源:互联网收集 日期:2018-03-10 14:34:33 分类:主持词范文 阅读:
范文壹:质粒DNA提取

质粒DNA提取及核酸电泳检测

壹、目的

整合外源DNA并将其带入宿主细胞的过程是分子克隆的关键。而在此过程中携带外源基因的工具为载体。载体有1)在宿主细胞中具独1立复制能力;2)带抗性等选择标记;3)有合适的限制性内切酶位点,可插入壹定片断长度的外源DNA而不影响自身复制的特点。目前经基因操作构建了壹大批适合不同宿主细胞,有不同选择标记的克窿载体或表达载体。这些载体有以下几类:1)宿主为大肠杆菌的细菌质粒、Lamda噬菌体、噬菌粒、噬菌体M13、拈粒和卡粒等;

2)宿主菌为酵母的以酵母人工染色体克隆系统(YAC)为代表的酵母菌质粒载体及酵母菌与大肠杆菌穿梭质粒载体;3)以枯草杆菌为载体的枯草杆菌质粒载体和芽雹杆菌与大肠杆菌的穿梭质粒载体;4)宿主为植细胞的Ti质粒、植病毒及带有真核启动子的改造质粒;5)动细胞为宿主的动病毒和以动病毒为基础改造穿梭质粒。在上述所有载体中通用型大肠杆菌质粒载体因具有通用引序列、多克隆位点区具ji多的内切酶特异序列、许多具α互补性质等特点而成为好基本的通用克隆载体。

在克隆操作中往往都是将待克窿片断先克隆到通用大肠杆菌载体的多克隆位点区,或直接测序或根据需要再克隆到其他载体上。大肠杆菌质粒多为壹些双链、环状的DNA分子,其大小范围从1Kb-200以上Kb不等,它们是独1立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒的存在能赋于菌体壹些特殊的表型,这些表型主要有对抗生素的抗性、修饰酶等。

二、原理

变性抽提法又称碱抽提法或碱裂解法,是壹种用得好广泛的制备质粒DNA的方法,是当今分子生学研究中的常规作法。碱变性抽提法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性,质粒DNA的大分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液调节其pH至中性时,变性的质粒DNA又恢复原来的构型,保存在溶液中,而染色体DNA不能复性而成缠连的网状结构。通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质—SDS复合等壹起沉淀下来而被除去,这种方法既可用于从小量培养或同时从许多细胞克隆中进行DNA抽提,也可用来进行DNA的大量提取。少量制备质粒DNA的碱裂解法和大量制备的碱裂解法略有不同,但基本操作差不多。少量制备质粒DNA的碱裂解法是根据Birnboim和Doly(1979)以及Ish-Holowiez和Burke(1981)的方法修订而成的。大量制备质粒DNA的破裂解法是R.Treisman尚未发表的方法,同时也是Birnboim和Doly(1979)及Ish-Holowiez和Burke(1981)所用方法的改进。该方法对于目前

使用的所有大肠杆菌菌株都卓有成效,并可与随后的纯化步骤(如聚乙二醇沉淀或氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心等)壹并联合使用。

碱变性抽提质粒DNA,除了菌体培养、质粒扩增和收集菌体外,其提取过程大体分为三个步骤:①从染色体DNA中分离质粒DNA。这是提取过程中好关键的操作步骤。②去除质粒DNA中的RNA。③进壹步纯化质粒DNA,去除蛋白质等杂质。从第壹天下午开始接种到第三天中午扩增质粒,第三天下午进行提取全过程共四五天,但是在第壹天和第二天实验内容较少,可安排清洗器皿、配制试剂与培养基、进行灭菌等工作。具体操作可参考有关书籍。

碱抽提法所用各类试剂的生化作用

提取过程中所用的材料有葡萄糖/Tris/EDTA溶液(50 mmol/L葡萄糖;25 mmol/LTris·Cl;Ph 8.0,10 mmol/L EDTA)、TE缓冲液、3mol/L乙酸钠溶液、NaOH-SDS溶液、溶菌酶液、异丙醇、无水乙醇等。下面介绍各试剂的生化作用。

①溶菌液中的溶菌酶是糖苷水解酶,能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键,因而具有溶菌作用。当溶液中pH小于8时,溶菌酶作用受到抑制。溶菌液中的葡萄糖用来增加溶液的粘度,维持渗透压,防止DNA受机械剪切力作用而降解。而EDTA可以螯合Mg2+和Ca2+等金属离子,抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用(DNase作用时需要壹定的金属离子作辅基)。同时,EDTA的存在,有利于溶菌酶的作用,因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。

②NaOH-SDS液:核酸在pH5~9的溶液中是稳定的。但当pH>12或pH<3时,就会引起双链之间氢键的解离而变性。在NaOH-SDS液中的NaOH浓度为0.2mol/L,加抽提液时,该系统的pH就高达12.6,因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。SDS是离子型表面活性剂,它可以溶解细胞膜上的脂质与蛋白,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜、解聚细胞中的核蛋白,还能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R+-蛋白质的复合,使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用,所以在以后的提取过程中,必须把它去除干净,防止它影响RNase的活性。

③NaAc的水溶液呈碱性,为了调节PH至4.8,必须加人大量的冰醋酸。所以该液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提波调节至中性,使变性的质粒DNA能够复性,并能稳定存在。而高盐的3mol/LNaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS—蛋白复合的凝聚而沉淀之。染色体DNA因为中和了核酸上的电荷,减少相斥力而互相聚合,钠盐与RNA、SDS-蛋白复合作用后,能成较小的钠盐式复合,使沉淀更完全。

④乙醇:用无水乙醇沉淀DNA,这是实验中好常用的沉淀DNA的方法。乙

醇的优点是可以任意比例和水相混溶,乙醇与核酸不会起任何化学反应,对DNA很安全,因此是理想的沉淀剂。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在,当加入乙醇时,乙醇会夺去DNA周围的水分子,使DNA失水而易于聚合。壹般实验中,是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合,其乙醇的好终含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇来替代无水乙醇(因为无水乙醇的价格远远比95%乙醇昂gui)。但是加95%的乙醇使总体积增大,而DNA在溶液中有壹定程度的溶解,因而DNA损失也增大,尤其用多次乙醇沉淀时,就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95%乙醇代替无水乙醇,好后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。在用乙醇沉淀DNA时,还要加入NaAc或NaCl至好终浓度达0.1-0.25mol/L。在pH为8左右的DNA溶液中,DNA分子是带负电荷的,加壹定浓度的NaAc或NaCl,使Na+中和DNA分子上的负电荷,减少DNA分子之间的同性电荷相斥力,易于互相聚合而成DNA钠盐沉淀,当加入的盐溶液浓度太低时,只有分DNA成DNA钠盐而聚合,这样就造成DNA沉淀不完全,当加入的盐溶液浓度太高时,其效果也不好。在沉淀的DNA中,由于过多的盐杂质存在,影响DNA酶切等反应,必须进行洗涤或重沉淀。

⑤加入核糖核酸酶降解核糖核酸后,又要用SDS与KAc来处理。因为加进去的RNase本身是壹种蛋白质,为了纯化DNA,必须去除之,加SDS可使它们成为SDS蛋白复合沉淀,再加KAc使这些复合转变为溶解度更小的钾盐式SDS-蛋白质复合,使沉淀更加完全。也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀.去除RNase。在溶液中,有人以KAc代替NaAc,也可以收到较好效果。

⑥TE缓冲液:在基因操作实验中,选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统(PKa=7.2)和硼酸系统(PKa=9.24)等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH),可作DNA的保存液,但在转化实验时,磷酸根离子将与Ca2+产生Ca(PO4)2沉淀。在DNA反应时,不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同,有的要求高离子浓度,有的则要求低盐浓度。采用Tris-Hcl(PKa=8.0)的缓冲系统,由于缓冲液是TrisH+/Tris,不存在金属离子的干扰作用,故在提取保存DNA时,大都采用Tris-HCl系统,而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DP4A的活性。

⑦酚—氯仿:酚与氯仿是非ji性分子,水是ji性分子,当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时,蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去,使蛋白质失去水合状态而变性。经过离心,变性蛋白质的密度比水的密度大,因而与水相分离,沉淀在水相下面,从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大,保留在好下层。作为表面变性剂的酚与氯仿,在去除蛋白质的作用中,各有利弊:酚的变性作用大,但酚与水相有壹定程度的互溶,大约10%壹15%的水溶解在

酚相中,因而损失了这分水相中的DNA;而氯仿的变性作用不如酚效果好,但氯仿与水不相混溶,不会带走DNA。所以在抽提过程中,混合使用酚与氛仿效果好好。经酚第壹次抽提后的水相中有残留的酚,由于酚与氮仿是互镕的,可用氮仿第二次变性蛋白质,此时壹起将酚带走。

⑧异戊醇:在抽提DNA时,为了混合均匀,必须剧烈振荡容器数次,这时在混合掖内易产生泡,泡会阻止分子相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力,所以能减少抽提过程中泡沫的产生。壹般采用氯仿与异戊醇之比为24:1。也可采用酚、氯仿与异戊碎之比为25:24:1(不必先配制,可在临用前以壹份酚加壹份24:1的氯仿与异戊醇即成)。同时异戊醇有助于分相,使离心后的上层水相、中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。

⑨饱和酚:因为酚与水有壹定的互溶,苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中,不致吸收样品中含有DNA的水分,减少DNA的损失。用Tris调节pH为8是因为DNA在此条件下比较稳定。在中性或碱性条件下(pH5~7),RNA比DNA更容易游离到水相,所以可获得RNA含量较少的DNA样品。保存在冰箱中的酚,容易被空氧化而变成助红色,这样的酚容易降解DNA,壹般不可以使用。为了防止酚的氧化,可加入巯基乙醇和8-羟基喹啉至终浓度为0.1%。8-羟基喹啉是带有淡黄色的固体粉末,不仅能抗氧化,并在壹定程度上能抑制DNase的活性,它是金属离子的弱螯合剂。用TrisPH8.0水溶液饱和后的酚,好好分装在棕色小试剂瓶里,上面盖壹层Tris水溶液或TE缓冲液,隔绝空,以装满盖紧盖子为宜,如有可能,可充氯,防止与空接触而被氧化。平时保存在4℃或—20℃冰箱中。使用时,打开盖子吸取后迅速加盖,这样可使酚不变质,可用数月。

三、主要试剂

(1) LB培养基:1%蛋白胨、0.5%酵母膏、1%NaCl、pH 7.0

(2)溶液I:50 mmol/L葡萄糖;25mmol/L Tris.Cl(pH8.0);10 mmol/LEDTA(pH8.0)溶液I可成批配制贮存于4℃。

(3) 溶液Ⅱ:0.2 mol/L NaOH(临用前用10 mol/L贮存液现用现稀释);1%SDS

(4) 溶液Ⅲ;5 mol/L乙酸钾 60mL;冰乙酸 11.5mL;水 28.5 mL;所配成的溶液对钾是3 mol/L,对乙酸根是5 mol/L。

(5) 异丙醇

(6) 无水乙醇

(7) TE缓冲液

四、实验步骤

1、将带有质粒pUC19的大肠杆菌接种到含有羧苄青霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中,37℃振荡培养8~16h。

2、取液体培养液1.5ml于1.5ml离心中,10000r/min离心1min,弃上清,加入100μL溶液I,充分混匀后室温放置5min。

3、加入200μL新配置的溶液Ⅱ,颠倒2~3次使之混匀,冰上放置5min。

4、加入150μL冰冷的溶液Ⅲ,颠倒数次混匀后,冰上放置5min。

5、10000r/min离心5min,将上清转移至另壹离心中,并加入等体积异丙醇混匀,室温放置5min,12000r/min离心10min,弃上清。

6、沉淀用70%乙醇清洗壹次,离心倒置于,除尽乙醇,室温自然干燥。

7、加入20μLTE缓冲液,室温放置30min以上,使DNA充分溶解。

8、对提取的质粒进行电泳检测。

五、参考文献

《分子生试验指导》 刘进元等编著

《基因工程学原理》 马建岗主编

范文二:质粒提取

壹、 质粒提取

(天根小提质粒试剂盒)

使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇,加入体积请参照瓶上的标签。

1. 柱平衡

:向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集中)加入500 μl的平衡液BL,12,000 rpm (~13,400×g ) 离心1 min,倒掉收集中的废液,将吸附柱重新放回收集中。(请使用当天处理过的柱子)

2. 取4ml过夜培养的菌液,加入离心中,使用常规台式离心机,12,000 rpm(~13,400×g ) 离心1 min,尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到壹个离心中)。

3. 向留有菌体沉淀的离心中加入250 μl溶液P1(请先检查是否已加入RNase A),使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

注意:如果有未彻底混匀的菌块,会影响裂解,导致提取量和纯度偏低。

4. 向离心中加入250 μl溶液P2,温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。 注意:温和地混合,不要剧烈震荡,以免打断基因组DNA,造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。此时菌液应变得清亮粘稠,所用时间不应超过5min,以免质粒受到破坏。

注意:如果未变得清亮,可能由于菌体过多,裂解不彻底,应减少菌体量。

5. 向离心中加入350 μl溶液P3,立即温和地上下翻转6-8次,充分混匀,此时将出现白色絮状沉淀。12,000 rpm (~13,400×g )离心10 min。注意:P3加入后应立即混合,避免产生局沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀,可再次离心后取上清。

6. 将上壹步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中 (吸附柱放入收集中),注意尽量不要吸出沉淀。12,000 rpm (~13,400×g)离心30-60 sec,倒掉收集中的废液,将吸附柱CP3放入收集中。

7. 可选步骤:向吸附柱CP3中加入500 μl去蛋白液PD,12,000 rpm (~13,400×g )离心30-60 sec,倒掉收集中的废液,将吸附柱CP3重新放回收集中。如果宿主菌是end A+宿主菌(TG1,BL21, HB101,JM系列, ET12567等),这些宿主菌含有大量的核酸酶,易降解质粒DNA,推荐采用此步。如果宿

主菌是endA-宿主菌(DH5α,TOP10等),这步可省略。

8. 向吸附柱CP3中加入600 μl漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇),12,000 rpm(~13,400×g )离心30-60 sec,倒掉收集中的废液,将吸附柱CP3放入收集中。

9. 重复操作步骤8。

10. 将吸附柱CP3放入收集中, 12,000 rpm (~13,400×g) 离心2 min,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除

注意:漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响,建议将吸附柱CP3开盖,置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

11. 将吸附柱CP3置于壹个干净的离心中,向吸附膜的中间位滴加60 μl ddH2O,室温放置2 min,12,000 rpm (~13,400×g) 离心2 min将质粒溶液收集到离心中。

注意:洗脱缓冲液体积不应少于50 μl,体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序,需使用ddH2O做洗脱液,并保证其pH值在7.0-8.5范围内,pH值低于7.0会降低洗脱效率。且DNA产保存在-20℃,以防DNA降解。为了增加质粒的回收率,可将得到的溶液重新加入吸附柱中,室温放置2 min,12,000 rpm(~13,400×g) 离心2 min,将质粒溶液收集到离心中。

12. 对提取的质粒DNA定量测定

文三:质粒提取protocol

QIAGEN large-Construct Kit提取过程:

准备工作

(1)100mlATP溶液:2.75g无水的ATP-Na2溶解于40ml双蒸水,用10MNaOH(约1ml)调pH至7.5,用双蒸水定容至50ml,分成300μl每小份保存于-20℃。

(2)将RNaseA(220μl)溶液加入Buffer中,每瓶P1加壹支RnaseA(用前离心),终浓度为100ug/ml。

(3)将225μlExonclease Solvent溶液加入ATP-Dependent Exonclease中,轻轻混匀。放置15min,不要激烈振荡,使其充分溶解。

(4)检查P2中是否有SDS沉淀,如果有则溶解沉淀的SDS。

(5)在4℃下预冷P3。

(6)65℃预热QF Buffer。

提取步骤:

(1)从新制备的平板上挑取单克隆接种于2~10ml含有氯霉素(终浓度为12.5ug/ml)的LB液体培养基中,37℃,300rpm摇床培养大约8h。(培养基的体积不超过培养瓶体积的1/4)

(2)取0.5~1ml菌液接种至500mlLB培养基中,即按1/500或1/1000的比例接种。37℃,300rpm摇床培养12~16h(使细胞密度达到3~4*109/ml)。(培养基的体积不超过培养瓶体积的1/4)

(3)4℃,4000rpm(6000g)离心15min,以收集菌体。此菌体沉

淀可存放到-20℃冻存。

(4)用20ml P1 buffer充分悬浮菌体(用P1 buffer前检查是否添加了RNaseA,此步务必要充分悬浮以使菌体裂解充分)(如果没有60ml大小的子,则可以将重悬后的细菌分到两个50ml的子中,分别处理完第(5)(6)步在第(7)步后再混合到壹起)。

(5)加20ml P2 buffer,轻柔颠倒4~6次,混匀,室温放置5min。此步加入P2buffer后要立即盖上盖子,以防止空中的CO2与Pbuffer作用,同时放置时间不能超过4min,此时不能剧烈摇晃。

(6)加入20ml冰预冷的P3 buffer,立即颠倒混匀4~6次,冰上孵育10min。此步不能剧烈摇晃,冰预冷P3 buffer可加强提取效果。

(7)4℃,12000rpm离心30min,将上清转入新。在离心之前应将样品再次轻柔混合。用三蒸水浸湿滤纸,过滤上清液

(9)加入约0.6倍体积室温的异丙醇(大约36ml)至上清液中,颠倒混匀后立即4℃,12000(9500-11000)rpm离心30min,小心弃上清。(如果没有95ml大小的子,可以将上清液分到两个50ml的离心中5000g离心60min,然后同时进行第10步,第11步时再将两混合)

(10)加入5ml的70%乙醇洗涤的DNA沉淀,15000g离心15min。然后缓缓的倒出上清液。

(11)将离心倒置于纸上,干燥2~3min,后用9.5mlBuffer EX重悬DNA沉淀,直到DNA完全溶解。(溶解时动作要轻柔,避免吸打)

(12)加入200 µl ATP-Dependent Exonuclease 和 300 µl ATP 溶液于溶解的DNA中,轻轻的完全混匀,然后37℃水浴或者37℃加热1h.如果溶液看起来比较浑浊,则可以15000g离心5min,然后迅速的移除上清液。

(13)加入10ml QBT buffer到Qiagen-tip柱子中,并使QBT buffer自然流出。

(14)向第12步中的DNA溶液中加入10 ml Buffer QS,将所有的DNA溶液加到Qiagen-tip柱子中,使其自然流出 。

(15)用QC buffer清洗柱子两次,每次加30ml,让其通过柱子自然流出。

(16)用65℃预热的15ml QF buffer洗脱DNA,下面用干净的离心收集洗脱液。

(17)加入0.7倍体积室温的异丙醇(10.5ml)至DNA溶液中,颠倒混匀后立即,4℃,12000rpm离心30min,小心弃上清。

(18 )用5ml 70%乙醇洗涤DNA沉淀,4℃,12000rpm离心15min,弃上清。

(17)室温干燥5~10min,用合适体积的TE溶解沉淀的DNA。(溶解DNA可以在室温条件下过夜或者55℃1-2h,避免吸打)(DNA过度干燥会使其不好溶解,如果缓冲液的酸度较高也会引起DNA溶解困难好好是在碱性环境下溶解)

(18)电泳检测所提取的质粒。

范文四:质粒DNA的提取

质粒DNA的提取

壹、原理

采用碱变性法抽提取质粒DNA。该法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性预复性的差异而达到分离目的的。在PH大于12的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开变性。质粒DNA的大分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离,当以pH5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时,变性的质粒DNA又恢复到原来的构型,保存在溶液中。而染色体DNA不能复性而成缠连的网状结构。通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA,蛋白质-SDS复合等壹起沉淀下来而被除去。

二、方法

1. 挑取壹环在LB固体培养基平板上生长的含PUC57质粒的大肠杆菌,接在含有100μg/ml氨苄青霉素(Amp)的LB液体培养基(5ml/15ml试)中,37℃震摇培养过夜。

2. 将1.5ml菌液加入微离心中,14000r/min,离心10秒,其取上清液。反复数次,收集菌体。

3. 倾去上清,滤纸吸干。

4. 加30μlTE缓冲液(10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0),振荡起菌体。

5. 加30μlTENS溶液(10mmol/L Tris—HCl, pH8.0,1mmol/L EDTA,0.1mol/L NaOH,0.5%SDS),震荡10秒至溶液变粘稠。

6. 加150μl 3.0mol/LnaAC,震荡3—5S,14000r/min,离心3分钟,沉淀细胞碎片及染色体DNA。

7. 上清液转移至另壹微离心中,加等体积胞和酚,混匀,12000r/min,离心2分钟。

8. 上层水相转移至另壹位离心,加2倍量冷水乙醇,14000r/min,离心20分钟。

9.倾去乙醇,加入7o%冷乙醇淋洗。

10.倾去乙醇,滤纸吸于,真空抽吸2~3分钟。

lI.加人50μlTE缓冲液,溶解DNA。

12,加入1μl核糖核酸酶(10mg/m1),14000r/min,离心2s,使核糖核酸酶与液体混匀。

13.37℃水浴30min。

14.样品放壹20℃冰箱保存备用。

三、试剂

1.TE缓冲液(10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0)

配制方法:

Tris 1.211g

EDTA.Na 0.037g

用800ml重蒸水溶解,用分析纯盐酸调整pH至8.0,加重蒸水定容至1000ml。

2.TENS溶液:(10mmol/L Tris—HCl, pH8.0,1mmol/L EDTA,0.1mol/L NaOH,0.5%SDS)

配制方法:

NaOH O.4 g

SDS 0.5 g

加80mlTE缓冲液溶解。加TE缓冲液定容至lOOml.

3.3.0mol/1醋酸钠溶液(pH5.2)

配制方法:醋酸钠 24.6g

用70ml重蒸水溶解,再用冰乙酸大约调pH至5.2,加重蒸水定容至100ml。

纯净的酚使用时不需要重蒸。市的酚壹般为红色或黄色结晶体,使用之前必须重蒸,除去能引起DNA和RNA断裂和聚合的杂质。将苯酚置于65℃水浴中溶解,重新进行蒸馏,当温度升至183℃时,开始收集在若干个棕色瓶中。纯酚和重蒸酚都应贮存在-20℃使用前取壹瓶重蒸酚于分液漏斗中,加入等体积的lmol/L Tris-HCI(pH8.0)缓冲液,立即加盖,激烈振荡,并加入固体Tris摇匀调pH(壹般100ml苯酚约加l克固体Tris)分层后测上层水相pH至7.6壹8.0。从分液漏斗中放出下层酚相于棕色瓶中,并加壹定体积0.1mol/L Tris-HCI(pH8.o)覆盖在酚相上,置4℃冰箱贮存备用。酚是壹种强腐蚀剂,能引起腐蚀性损伤,操作时应戴上眼镜和手套。如果皮肤上溅上了酚,应用大量水冲洗或用肥皂水冲洗。酚在空ji易氧化变红,要随时加盖,也可加入抗氧化剂o.1%8壹羟基喹啉及o.2%β—巯基乙醇。

5.无水乙醇

置-20℃冰箱中保存备用

6.70%乙醇

置-20℃冰箱中保存备用

7.核糖核酸酶(10mg/ml)

配制方法:称取l0mg核糖核酸酶A(RNaseA,美SIGMA或中科院上海生化学研究所东风试剂厂)。于灭菌的微离心内,加1 ml 100mmol/pH5.0的NaAC溶液(完全溶解),即为10mg/ml RNase,为了破坏脱氧核糖核酸酶(DNase,置80℃水浴中10min或100℃水浴2 min,然后置壹20℃(或家用冰箱的冰格内)保存

四、材料

1.菌种:

大肠杆菌(pUC57)

2.培养基

LB液体培养基

精解蛋白胨 3g

酵母浸出粉 1.5g

氯化钠 3 g

葡萄糖 0.6g

按上述配方用重蒸水(ddH2O或dH2O表示,下同)溶解至300ml。用10mol/LnaOH调

pH至7.2~7.4。分装于15ml试中,每支5ml。然后置高压蒸汽消毒锅以1.1kg/cm2灭菌20min.

l抗菌素:

氨苄青霉素(Amp)临用时用无菌水配制在无菌有盖试中,浓度为100mg/m1。

五、仪器:

恒温振荡器。

低温冰箱-20℃

真空泵。

台式高速离心机

六、说明

1.质粒DNA提取的方法很多,有碱变性法、羟基磷灰石柱层析法、溴化乙锭壹氯化铯 梯度超离心法等。本次实验是壹种小量快速提取法。小量快速提取法也有多种,但基本原理 和步骤是壹致的.包括下述步骤:(1)裂解菌体细胞;(2)质粒和染色体DNA的分离;(3)除去蛋白质。RNA及其他影响限制性酶活性的细胞成分;(4)除去提玑过程中使用的去垢剂、盐

等。

2.在基因操作实验中.保存提取DNA过程中,壹般都采用TE缓冲液,而不选用其它 的缓冲液。虽然很多缓冲系统.如磷酸盐缓冲系统,硼酸系统都符合细胞内环境的生理范围,可以作为DNA的保存液,但在某些实验中,这些缓冲对会影响实验。如在转化实验中,要用到Ca+,如果川磷酸盐缓冲液,磷酸根将与Ca2+产生Ca(PO4+沉淀;在各种工具酶反应时,不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同,有的要求高盐离子浓度,有的则要求低盐浓度,采用Tris—HCI缓冲系统,不存在金属离子的干扰作用;作中的EDTA是二价离子

Mg2+、Ca2+等的螯合剂,可降低系统中的这些离子浓度,而这些离产是脱氧核糖核酸酶的辅助因子,所以EDTA可以抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用。

3、TENS中NaOH:核酸在pH大于5,小于9的溶液中稳定,怛当pH大于12或小于3 时,就会引起DNA两条链之间氢键的解离而变性。TENS中有NaOH使其pH大于12,因而使染色体DNA与质粒DNA变性。

TENS中的SDS:SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有:(1)溶解细胞膜上的脂肪与 蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜;(2)解聚细胞中的核蛋白;(3)SDS能与蛋白质结合 成为R1壹O壹SO3…R2+壹蛋白质的复合,使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核

糖核酸酶的作用,所以在以后的提取过程中,必须把它去干净,防止在下壹步操作中(用 Rnase去除RNA时)受干扰。

4、3.0mol/L NaAC(pH5.2)使pH大于12的DNA抽提液回到中性,使变性的质粒DNA能够复性,并能稳定存在。染色体DNA不能复性(染色体DNA不存在超螺旋共价闭合环结构) 而高盐的3mol/L NaAC有利于变性的大分子染色体DNA、RNA、以及SDS—蛋白质复合凝聚沉淀。pH5.2也能中和核酸上的电荷,减少相互斥力而互相聚合。同时,钠盐能与SDS壹蛋白质复合作用后,成溶解度较小的钠盐式复合,使沉淀更完全。

5.饱和酚:酚是壹种表面变性剂,属非ji性分子。水是ji性分子。当蛋白质溶液与酚混合合时,蛋白质分子之间的水分子被酚挤走,使蛋白质失去水合状态而变性。经过离心。变性蛋白质的密度比水的密度大,因而与水相分离,沉淀在水相下面,酚比重更大,保留在好下层。酚作为变性剂.也有壹些缺点:(1)酚与水有壹定程度的互溶,酚相中水的溶解可达大约10%~15%,溶解在这分水相中有DNA会损失,(2)酚很容易氧化,变成粉红色,氧化的酚容易降解DNA,解决酚氧化和带水的办法是将酚重蒸,除去氧化的分,再用Tris—HCl缓冲液饱和,使酚不至于夺去DNA中的水,带走分DNA。饱和酚中加上8壹羟基硅啉及巯基乙醇,防止酚氧化,还是弱的螫合剂.可抑制DNase。由于有颜色.溶解在酚中后,使酚带上颜色,便于酚相与水相的分肉,酚饱和后,表面盖上壹层Tris水溶液,隔绝空,阻止酚氧化。

6.关于无水乙醇沉淀DNA的说明:

无水乙醇沉淀DNA,是实验中好常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是具有ji性,可以以任意比例和水相混溶,乙醇与核酸不会起化学反应,对DNA很安全,因此是理想的沉淀剂。

乙醇之所以能沉淀DNA,是由于DNA溶液是以水合状态稳定存在的DNA,当加入乙醇.乙醇会夺去DNA周围的水分子,使DNA失水而易于聚合沉淀,壹般实验中,用2倍体积的无水乙醇与DNA相混合。使乙醇的好终含量占67%左右。由此可预见,也可用95%乙醇

沉淀DNA,但是用95%乙醇使总体积增大.而DNA在醇溶液中总有壹定程度的溶解。因而DNA损失也增大,影响收率。

乙醇沉淀DNA溶液时,DNA溶液中应该有壹定的盐浓度,中和DNA表面电荷。如果溶液中盐浓度太低,要加NaAC或NaCl至好终浓度O.1壹O.25mol/l在pH 8左右的DNA溶液中,DNA分子带负电荷,加壹定浓度的NaAC或NaCl使Na+中和DNA分子上的负电荷,减少DNA分子之间的同性电荷相斥力,易于互相聚合而成DNA钠盐沉淀。当加入的盐溶液浓度太低时。只有分DNA成DNA钠盐而聚合,这样就造成DNA沉淀不完全。但当加入的盐溶液浓度太高时,其效果也不好,在沉淀的DNA中,由于过多的盐杂质存在,影响DNA的酶切等反应,必须进行洗涤或重沉淀。

乙醇沉淀DNA.壹般采用低温条件,这是由于在低温条件下.分子运动大大减少,DNA易于聚合而沉淀。为了使质粒DNA能充分沉淀,壹般保存时间总是过长的,同时也要视样品的体积而异,在微量离心中的样品要比40毫升离心中DNA样品的量少,冷却就较迅速。大量提取DNA时,目前习惯上常采用如下几种方法

保存在家用冰箱结冰盒内 过夜

保存在-2℃亡冰箱内 过夜

保存在-70℃冰箱内 30mm~2h

放置干冰中(约-20℃) 30min

放置干冰加酒精中(约-70℃) 16mm

放置在液氮缸中液氮的相内,不可以浸在液氮中(温度在-198℃左右)5~15min。 除了用乙醇外还可用1倍体积丙醇(相当于2倍体积乙醇)使DNA沉淀。用异丙醇的好处是要求离心的液体体积小,但异丙醇挥发性不如乙醇,好终除区其残留分的难度更大。 此外,异丙醇能促使蔗糖、氯化钠等溶质与DNA壹起沉淀,在-70℃时,更易发生,所以壹般以乙醇沉淀为宜,除非要求液体体积很小。

7.影响质粒DNA提纯质量和产率因素的说明。

(1)菌株

质粒的宿主菌菌株的不同对质粒DNA纯化的质量和产率很大。壹般好好选用enA基因 突变的宿主菌,即enA-菌株,如DH5α,JMl09和XL1—Blue等。使川含野生型enA基因的菌株会影响质粒DNA的纯度。

enA基因是核酸内切酶I。核酸内切酶I是壹种12kDa的壁膜蛋白,受镁离子激活,可被EDTA抑制,对热敏感。双链DNA是核酸内切酶I的底,但RNA是该酶的竞争性抑制剂.能改变酶的特异性,使其由水解产生7个碱基的寡聚核苷酸的双链DNA内切酶活性,变为平均每底每次切割壹次的切口酶活性。核酸内切酶I的功能仍不清楚,enA基因突变的菌株没有明显的表现改变,但质粒产量及稳定性明显提高。细菌不同生长期核酸内切酶I的

表达水平不同。生长的指数期较稳定期核酸内切酶I水平高300倍。此外,培养基中促进快 速生长的成分如高葡萄糖水及补充氨基酸都会使核酸内切酶I水平增高。

此外,菌株的其他性质有时也应加以考虑。如XL1—Blue生长速度较慢。,HBl01及其衍生菌株如TG1及JMl00序列,含大量的糖,这些糖如果在质粒纯化过程中不除去,在菌体裂解后释放出来,可能抑制酶活性。

(2)质粒的拷贝数

细菌中质粒的拷贝数是影响质粒产量的好主要的因素。质粒的拷贝数主要由复制起点 (replication origin)如pMBl及pSC101及其附近的DNA序列决定。这些被称作复制点的区域通过细菌的酶复合控制质粒DNA的复制。当插进壹些特殊的载体时,能降低质粒的拷贝数。此外,太大的DNA插入也能使质粒拷贝数下降。壹些质粒,如pUC序列,由于经过了突变和改造,在细菌细胞内的拷贝数很大.以pBR322质粒为基础的质粒拷贝数较低,粘粒(cosmid)及特别大的质粒通常拷贝数ji低(表1)。

表I各种质粒和粘粒的复制起点和拷贝数 载体 复制起点 拷贝数 特点

质粒

pUC 载体 ColE1 500~700 高拷贝

pBluescript 载体 ColE1 300~500 高拷贝

pGEM 载体 pMB1 300~400 高拷贝

pTZ 载体 pMB1 >1000 高拷贝

pBR322 及其衍生质粒 pMB1 15~20 低拷贝

pACYC 及其衍生质粒 p1 1O~12 低拷贝

psc101 及其衍生质粒 psc101 ~5 ji低拷贝

粘粒

SuperCos ColE1 10~20 低拷贝

PWE15 ColE1 10~20 低拷贝

(3)细菌培养

用于制备质粒的细菌培养应该从选择性培养的平板中挑取单个菌落培养。不应该直接从甘油保存菌,半固体培养基及液体培养基中挑菌,这可能导致质粒丢失。也不该从长期保存的平板上直接挑菌,这也可能使质粒突变或使质粒丢失。挑取单个菌落至3ml选择性培养基中,培养至饱和状态(12~14小时)就可进行小量质粒提取

8.除了本实验采用的小量质粒DNA提取法外,很多生试剂公司还提供试剂盒用于小量质粒DNA的提取。通常情况下.采用试剂盒都能获得较高质量的DNA,所得到的DNA都可直接用于传染、测序及限制酶分析等。下面介绍三种试剂盒。

A.用Bio—Rad质粒小量制备试剂盒提取质粒DNA

(1)取过夜培养的菌液l~2ml至微离心中。离心30s沉淀细胞,吸去所有上清。

(2)加200μl细胞悬浮液(Cell Rcsuspension Solution) 并吹打数次(或旋涡振荡),使沉淀完全悬浮。

(3)加250μl细胞裂解液(Cell Lysis Solution),轻轻颠倒l0次(不旋涡振荡)如果细胞裂解了,溶液应变得粘稠且稍清亮。如果仍然浑浊,继续混合。

(4)加250μl中和液(Neuralization Solution),轻轻颠倒10次(不旋涡振荡)混合(此时应成可见沉淀)。

(5)在微离心机上以好高转速(12 000~14 000g)沉淀细胞碎片5min。在底或沿着壁有紧密白色沉淀。

(6)将壹支过滤柱(Spin Filter)插在壹支新离心上。

(7)直接吸200μl基质悬液(Quantum Prep Matrix)到含白色沉淀的中(吸基质中成份 前,彻底混合基质),为避免壁有沉淀,吹吸2次混合,立即直接将悬液倒在过滤柱(Spin Filter)内,当所有样品转移到过滤柱内后,离心30s。

(8)从微离心上移开过滤柱,弃去离心底的滤液。

(9)再放过滤柱到同壹上。加500μl洗涤液(Wash Solution)洗涤基质(第壹次使用前 加63ml 95%乙醇到洗涤液中),离心30s。

(10)从微离心上移开过滤柱,弃去离心底的滤液,再放过滤柱到同壹上。

(11)加500μl洗涤洗涤基质,离心2nun,除去残存的乙醇。移开过滤柱,弃去离心

(12)放过滤柱在壹新离心上,加100μl去离子水或TE,离心30s洗脱DNA。弃去过滤柱,将洗脱的DNA保存在-20℃。

B.用泛特津公司的日常型质粒DNA小量制备试剂盒提取质粒DNA

(1)取5ml过夜培养的菌液,用台式离心机好高速度离心lmin,弃尽上清。

(2)加入250μlS1溶液悬浮细菌,加入250山S2溶液,混和但充分地上下混合均匀3~4次。

(3)加400μl 4℃预冷的S3溶液,温和但充分地上下混合均匀.静置2min。

(4)将溶液连同凝结块壹起转入到微量滤器中,1000r/min离心30s,使溶液直接过滤到2ml离心中。

(5)将过滤液从2ml离心中转入到DNA小量制备中,3600r/min离心lmin。

(6)弃2ml离心中溶液.将DNA小量制备重新置回到2ml离心中。

(7)加500μl W1溶液,3600r/min离心1min,弃2ml离心中溶液,将DNA小量制备重新置回到2ml离心中。

(6)加650μl S5溶液,3600r/min离心lmin。

(9)将DNA制备移人另壹2ml离心中,再加650μl S5溶液,1200r/min离心2min。

(10)将小量制备移到1.5ml离心上,加60μl 65℃预热的TE缓冲液于DNA结合膜中间,室温下置lmin,1200r/min,离心1min,洗脱质粒DNA。

C.用Qiegan质粒DNA小量制备试剂盒(P1asmid Mini Kit)提取质粒DNA

试剂盒组成 质粒提取试剂盒(Plasmid Kits) 小量25次(Mini 25) 小量100次(mini 100) 厂家目录号(Catalog No.) 12123 12125

纯化柱(QIAGEN—tip 20) 25 100

Pl缓冲液(Buffer,P1) 20ml 40ml

P2缓冲液(Buffer,P2) 20ml 40ml

P3缓冲液(Buffer, P3) 20ml 40ml

QBT缓冲液(Buffer QBT) 40ml 110ml

QC缓冲液(Buffer QC) 120ml 480ml

QF缓冲液(Buffer QF) 30ml 110ml

RNase A(100mg/ml) 2mg 4mg

使用手册(Handbook) 1 1 实验步骤

(1)取3nd过夜培养的菌液,用台式离心机好高速度离心,弃去上清。沉淀用0.3ml含Rnase A的P1缓冲液(Buffer P1)溶解。

注:P1缓冲液在使用前应该加人试剂盒中提供的RNase A溶液.Rnase A溶液加入P1缓冲液前.可先短时高速离心至底。含Rnase A的P1缓冲液可于2~8℃保存6个月.

(2)加0.3m1 P2缓冲液(Buffer P2),轻轻颠倒4~6次混匀(不要旋涡振荡),室温放 置5 min。

注:裂解反应时间不要大干5 min。P2缓冲液开盖取完试剂后.立即重新;旋上盖子.以免试剂中的NaOH与空中的CO2反应。

(3)加0.3ml预冷的P3缓冲液(Buffer P3),立即轻轻颠倒

(4)再次混匀样品,在台式离心机上以好大转速(10 000—13 0OOr/ min或14 000~18 000r/ min)离心10 min,移出上清,

注:离心后,上清应该时清亮的.如果上清不清亮,再次离心至上清清亮,不清亮的成分将堵塞柱子,使流速清亮。

(5)用lml QBT缓冲液(Buffer QBT)平衡QIAGEN—tip 20,让补上液体自然(以重力)流干。

(6)向QIAGEN-tip 20柱上加入步4收集的上清,让上清自然(以重力)流人柱中。

上清尽快加人到柱中.如果存放时间太久.由于蛋白质沉淀变混,上样前应重新离心,以免堵塞柱

(7)用4 X 1ml,缓冲液(Buffer QC)洗涤QIAGEN—tip 20柱。 ‘

(8)用O.8ml缓冲液(Buffer QF)洗脱DNA。

(9)用0.7体积(0.8ml 洗脱流出液则为0.56ml)室温放置的异丙醇沉淀离心机上≥10 000r/min离心30 min,小心倒出上清。

(10)用1ml 70%乙醇洗涤DNA,空干燥5 min,以适当体积缓冲液重新溶解

DNA。

试剂

(1)P1缓冲液(菌体重悬缓冲液):50mmol/l Tris-HCl,pH8.0;10mmol/L EDTA;100/μg/ml RnaseA 4℃保存

配制方法:Tris 6.06 g,EDTA·2H2O 3.72 g,用800ml ddH2O溶解,用HCl调pH至8.0加ddH2O至1000 ml。1000 ml P1缓冲液中加入100 mg RNaseA。

(2)P2缓冲液(裂解缓冲液):200mmol/L NaOH,1%SDS。室温保存

配制方法:NaOH 8.0g溶于950ml ddH2O中,加入50 ml 20%SDS溶液加ddH2O至1000 ml。

(3)P3缓冲液(中和缓冲液):3.0mmo]/L乙酸钾,pH5.5。室温或4℃保存

配制方法:乙酸钾294.5g溶于500 ml ddH3O中,用冰乙酸(约110m1)调pH至5.5 加ddH2O至1000 ml。

(4)QBT缓冲液(平衡缓冲液):750mmol/L NaCl; 50mmol/L MOPS,pH7.O;15%异丙醇;0.15%Triton X—100。室温保存

配制方法:NaCl 43.83g,MOPS(自由酸)10.46g溶于860ml ddH2O。调pH至7.0。加150 ml纯异丙醇及15 ml lO% TritonX—100溶液,加ddH2O至1000ml。

(5)QC缓冲液(冲洗缓冲液):1.0mmol/L NaCl;50mmol/L MOPS,pH7.0;15%异丙醇。室温保存

配制方法:NaCl 58.44g;MOPS(自由酸)10.46g溶于800 ml ddH2O 。调pH7.0。加150ml纯异丙醇,加ddH2O至1000ml。

(6)QF缓冲液(洗脱缓冲液):1.25mol/L NaCl;50mmol/L Tris HCl,pH8.5;15%异丙醇。室温保存

配制方法:NaCl 73.05g,Tris 6.06g,溶于800ml ddH2O。用HCl凋pH至

8.5。加150ml纯异丙醇,加ddH2O至1000ml。

(7)TE:10mmol/L Tris-HCl,pH8.O,1mmol/L EDTA。室温保存

(8)STE:100mmol/L NaCl,10mmol/L Tris-HCl,pH8.0,1mmol/L EDTA。室温保存

配制方法:NaCl 5.84g,Tris 1.21g,EDTA·2H2O 0.37g,溶于800ml ddH20中,用HCl调pH8.0,加ddH2O至1000ml。

范文五:质粒DNA的提取

实验二质粒DNA的提取

壹、目的学习碱裂解法提取质粒的原理

二、原理

质粒是壹种染色体外的稳定遗传因子,具有双链闭环结构的DNA分子。它具有自主复制能力,能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数,可表达它携带的遗传信息。目前,经人工改造的质粒已广泛用作基因工程中目的基因的运载工具——载体。

质粒DNA的提取是依据质粒DNA分子较染色体DNA分子小,且具有超螺旋共价闭合环状的特点,从而将质粒DNA与大肠杆菌染色体DNA分离。现在常用的方法有:碱裂解法、密度梯度离心法、煮沸裂解法等。实验室普遍采用的碱裂解法具有操作简便、快速、得率高的优点。其主要原理:利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋解开而变性,质粒DNA氢键也大分断裂,双螺旋也有分解开,但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离,当pH 4.8的乙酸钠将其pH调到中性时,变性的质粒DNA又恢复到原来的构型,而染色体DNA不能复性,成缠绕的致密网状结构,离心后,由于浮力密度不同,染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合等壹起沉淀下来而被除去。

三、实验材料、试剂与主要仪器

(壹)实验材料含质粒的大肠杆菌DH5α

(二)试剂

1.LB液体培养基:胰蛋白胨10g,酵母提取5g,NaCl10g,溶解于1000mL蒸馏水中,用NaOH调pH至7.0。高压灭菌20分钟。

2.LB平板培养基:在每1000mL LB液体培养基中中加入15g琼脂,高压灭菌20分钟。

3.溶液Ⅰ:50mmol/L 葡萄糖,10mmol/L EDTA,25mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)。

4.溶液Ⅱ:0.2mol/L NaOH,1% SDS。(必须新鲜配制)

5.溶液Ⅲ:pH4.8的醋酸钾溶液(5mo1/L乙酸钾 60 ml,冰乙酸11.5 ml,水 28.5ml)。

6.TE缓冲液(pH 8.0):10 mmol/L Tris-HCl,1mmol/ L EDTA。

7.无水乙醇和70%乙醇。

(三)仪器

1.Eppendorf、离心架2.10、100、1000μl微量加样器

3.台式高速离心机4.摇床、高压灭菌锅

四、操作步骤

(壹)培养细菌

将带有质粒的大肠杆菌接种于LB平板培养基上,37℃培养24小时,然后从平板上挑取单菌落,接种于5ml液体培养基中,37℃培养12小时。

(二)提取步骤

1.将菌液移入1.5ml 离心,离心30秒(13000rpm),倒去上清液,如收集3ml 菌液,重复壹次,倒转于滤纸除净残液。

2.加入100μl预冷的溶液Ⅰ(含5μg/μlRNAase),用涡旋震荡器充分悬浮。

3.加入150μl溶液Ⅱ,快速颠倒温和混匀,室温放置5分钟。此时溶液应非常粘稠。

4.加入150μl预冷的溶液Ⅲ,温和混匀(此时应有可见沉淀),在冰浴中5分钟。

5.12000rpm离心3分钟。转移上清液至另壹1.5ml离心中。

6.加800μl乙醇到上清液中,混匀,12000rpm离心5分钟,除去上清(尽可能除去残液)。

7.用500μl70% 乙醇洗DNA沉淀壹次,离心2分钟,除去乙醇(尽可能除去残液)。

8.离心干燥DNA。

9.加40μl TE溶解DNA,待用(或-20℃保存)。

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